Лаборатория молекулярной эндокринологии

(РУКОВОДИТЕЛЬ  - АКАДЕМИК В.А.ТКАЧУК)

Лаборатория образована в 1982 г.

Основные направления научных исследований:

Исследования, сосредоточенные в основном на изучении процессов рецепции и внутриклеточной сигнализации, с целью выяснения молекулярных механизмов регуляции ремоделирования и роста кровеносных сосудов, миграции, пролиферации и дифференцировки эндотелиальных и гладкомышечных клеток. Изучение ассоциации вариантов генов-модификаторов с развитием нарушений свертывания крови, рисками развития ИБС и инфаркта миокарда, а также с тяжестью течения семейной гиперхолестеринемии и гипертрофической кардиомиопатии. Исследования компонентов фибринолитической системы и навигационных рецепторов в процессах роста сосудов и нервов и ремоделирования сосудов (в сотрудничестве с лабораторией генной инженерии).

В 80-х годах В.А.Ткачук и его коллеги изучали роль разных типов G-белков (а также их субъединиц) в регуляции аденилатциклазы и Ca2+-каналов в сердце, сосудистых, эндотелиальных и гладкомышечных клетках, а также тромбоцитах. Ими был установлен молекулярный механизм влияния G-белков на развитие гиперчувствительности и толерантности данных клеток к действию катехоламинов и некоторых лекарственных препаратов. Было показано, что нарушения чувствительности клеток к их регуляторам происходят при гипертонии, нестабильной стенокардии, инфаркте миокарда, при хронической гипоксии. Впервые также установлено, что гипоксия вызывает активацию фосфоинозитидного обмена в эндотелиальных клетках человека, в результате чего активированная протеинкиназа С стимулирует эндоцитоз b-адренергических рецепторов, что приводит к развитию толерантности этих клеток к действию катехоламинов. При глубокой гипоксии и аноксии с поверхности эндотелиальных клеток исчезают АТФ- и АДФ-гидролизующие ферменты, что приводит к усилению пуринергической стимуляции агрегации тромбоцитов и секреции гормо-нов эндотелием.

Выявлено было также, что гипертрофия миокарда приводит к повышенной экспрессии бэта-2-адренергических рецепторов, а повреждение сердца и сосудистых клеток сопровождается экспрессией в них АТ2-рецепторов ангиотензина II, которые (в отличие от АТ1-рецепторов) вызывают дефосфорилирование внутриклеточных белков. При изучении клеток крови и сосудов В.А.Ткачук и соавт. обнаружили потенцирующее влияние липопротеидов на стимулирующую адреналином агрегацию тромбоцитов, а также на Ca2+-мобилизующие эффекты ангиотензина и эндотелина в сосудистых гладкомышечных клетках. На эндотелиальных и гладкомышечных клетках человека было показано, что липопротеиды низкой плотности стимулируют фосфоинозитидный обмен и выход Ca2+из эндоплазматического ретикулума, и этот эффект опосредуется не апоВ/Е-рецептором (классическим рецептором этих липопротеидов), так как он проявляется в клетках гомозиготных больных семейной гиперхолестеринемией, а также у кроликов Ватанабе, у которых эти рецепторы нефункциональны из-за генетического деффекта. Были проведены выделе-ние из аорты человека, очистка и идентификация нового липопротеидсвязывающего белка, специфически экспрессирующегося только в клетках сердца и кровеносных сосудах. Этим белком оказался Т-кадгерин – белок, ответственный за гомофильное взаимодействие кле-ток. Коллективом лаборатории показано, что в отличие от других кадгеринов (N, E, VE и др.), Т-кадгерин оказывает антиадгезивное действие на взаимодействие эндотелиальных клеток, концентрируется на лидирующей поверхности мигрирующей клетки, участвует в перестройке ее цитоскелета. Получены свидетельства в пользу того, что Т-кадгерин является навигационным рецептором, позволяющим мигрирующим клеткам и растущим кровеносным сосудам избегать определенных тканей, а связывание липопротеидов с Т-кадгерином может нарушать ангиогенез и влиять на ремоделирование сердца и сосудов. Установлено, что Т-кадгерин способен влиять на проницаемость эндотелия.

В последние 15 лет исследования в лаборатории В.А.Ткачука были направлены на выяснение молекулярных механизмов ремоделирования и роста кровеносных сосудов. Обнаружено, что повреждение сосуда приводит к экспрессии урокиназы и ее рецептора в сосудистых клетках, которые являются ключевыми участниками миграции клеток крови и сосудов в просвет сосуда. Показано, что урокиназа связывается со своим рецептором (через N-концевой домен), который всегда концентрируется на полюсе клетки, наиболее близком к хемоаттрактанту. В результате этого взаимодействия активируется MAP-киназа (p38) и происходит независимая от Ca2+ перестройка актинового и актомиозинового комплекса, что обеспечивает движение клетки по градиенту концентрации хемоаттрактанта. Установлено, что урокиназа стимулирует миграцию клеток, связываясь с белком внеклеточного матрикса фибулином-5 и вызывая плазмин-зависимое расщепление последнего. Было показано, что урокиназа действует как цитокин, кторый стимулирует JAK и STAT-белки, нуклеолин, казеинкиназу II и др.), а также обладает протеазной активностью. Концентрирование этой протеазы на лидирующей поверхности мигрирующей клетки позволяет разрушать матриксные белки, причем этот процесс осуществляется как путем активации плазминогена, так и путем прямого стимулирующего влияния урокиназы на экспрессию матриксных протеаз 2- и 9-типов. Сотрудниками лаборатории впервые была определена вторичная структура ростового домена урокиназы. Показано, что урокиназа вызывает негативное (констриктивное) ремоделирование кровеносных сосудов путем стимулирующего влияния на синтез НАДФН-зависимых ферментов (NOX), участвующих в оксидативном стрессе и воспалительных реакциях.

В последние 5 лет был исследован механизм регуляции миграции клеток с участием оксидативных медиаторов и ферментов NOX. Для этого были использованы биосенсорные технологии и прижизненная микроскопия одиночных клеток. Было обнаружено, что активация хемотактических рецепторов сопровождается активацией NOX и накоплением в клетках пероксид водорода – конечного метаболита оксидативных медиаторов. Пероксид водорода формирует внутриклеточные градиенты, направленные в сторону движения клетки. Ингибирование рецептор-зависимой активации NOX или образования пероксида тормозит движение и деление клеток. Полученные результаты позволили выдвинуть гипотезу о том, что пероксид водорода действует как вторичный посредник и опосредует активирующее действие факторов роста, цитокинов и урокиназы на миграцию и пролиферацию клеток.

Наконец, текущие исследования в лаборатории направлены на выяснение молекулярных механизмов адипоцитарной дифференцировки и развития инсулиновой резистентности. Описан новый транскрипционный фактор Prep1, который контролирует активность PPARγ – мастер-регулятора адипогенеза и липидного метаболизма. Предварительные данные, в том числе с использованием нокаутных животных моделей, показывают, что Prep1 подавляет адипогенез, но и снижает чувствительность жировых клеток к инсулину. В настоящее время определяется механизм действия Prep1 и ведется поиск его мишеней в геноме адипоцитов.

Наиболее значимые результаты исследований последних лет

Впервые идентифицирован новый рецептор липопротеидов Т-кадгерин – белок, ответственный за гомофильное взаимодействие клеток. Продемонстрирована зависимость экспрессии Т-кадгерина от пролиферативного статуса клетки, показано влияние его экспрессии на клеточный фенотип и навигацию растущих сосудов и нервов, а также на чувствительность клеток к гормонам и факторам роста. Т-кадгерин функционирует в клетках сосудов и сердца, влияет на рост сосудов, подавляет онкологический рост, изменяет проницаемость эндотелия и участвует в регуляции процессов эндотелиальный дисфункции. Изучая механизмы регуляции барьерной функции эндотелия было показано, что гиперэкспрессия Т-кадгерина разрушает адгезивные межклеточные контакты, вызывая формирование щелей в зоне VE-кадгериновых адгезивных контактов. При этом повышенная экспрессия Т-кадгерина приводит к избирательному фосфорилированию VE-кадгерина по тирозину в 731 положении (Y731, бета-катенин – связывающий сайт), эндоцитозу VE-кадгерина с участием клатрина и деградации его в лизосомах. Более того, повышенная экспрессия Т-кадгерина приводит к активации Rho ГТФаз и формированию стресс-фибрилл актина. Изучая экспрессию Т-кадгерина в различных новообразованиях кожи было обнаружено, что потеря экспрессии Т-кадгерина в кератиноцитах эпидермиса биологически связана со злокачественной трансформацией нормальных клеток эпидермиса. На основании проведённого исследования было сделано предположение, что Т-кадгерин может участвовать в поддержании целостности ткани в нормальных условиях путём предотвращения перемещения клеток, именно поэтому экспрессия Т-кадгерина наиболее выражена в кератиноцитах базального слоя, прикрепленных к базальной мембране и разграничивающих эпидермис и дерму. При малигнизации можно наблюдать мозаичный паттерн экспрессии Т-кадгерина в первичных меланоцитах и полную или частичную потерю экспрессии Т-кадгерина в тканях метастаз в лёгких. Эти данные указывают на корреляционную связь между прогрессированием опухоли и потерей экспрессии Т-кадгерина. В меланоме Т-кадгерин стимулирует пролиферацию клеток самой меланомы и привлечение мезенхимальных стромальных клеток, но в тоже время подавляет ангиогенез в первичном узле меланомы. Продемонстрирована сигнальная роль липопротеидов плазмы крови. Показано, что при связывании с Т-кадгерином липопротеиды потенцируют действие гормонов и факторов роста на сосудистые клетки.

• Вместе с сотрудниками НИИ клинической кардиологии налажены методы молекулярной генетики, с помощью которых ведется исследование семейной гиперхолестеринемии и гипертрофической кардиомиопатии. У пациентов с этими заболеваниями обнаружен спектр мутаций и полиморфизмов, что позволяет в ряде случаев проводить дифференцированную диагностику и персонифицированную терапию.

• В гене рецептора липопротеидов низкой плотности обнаружено 8 новых мутаций, которые являются причиной возникновения семейной гиперхолестеринемии в российской популяции.

• Изучены механизмы возникновения толерантности к действию гормонов и фармакологических препаратов и показана роль гипоксии в этих процессах.

• Продолжено изучение механизмов роста и ремоделирования сосудов, в частности, роли урокиназы - уникального регулятора внеклеточного протеолиза, миграции и пролиферации клеток в этих процессах. Впервые обнаружено участие урокиназы в отрицательном ремоделировании зрелых кровеносных сосудов. Установлено, что это происходит за счет рецепторно-опосредованного каскада фосфорилирования, проникновения урокиназы в ядро клетки и экспрессии синтеза ряда оксидативных медиаторов и ферментов (NOX-1 и NOX-4). Установлено, что урокиназа стимулирует ангиогенез. С помощью микроэрреев были обнаружены две большие группы генов, экспрессия которых меняется при экзогенном нанесении рекомбинантной урокиназы на поврежденную сосудистую стенку. Это воспалительные гены и гены, вовлеченные в ред-окс сигнализацию, а также матриксные металлопротеиназы.

• Показано, что связывание урокиназы с рецептором приводит к запуску сигнальных каскадов внутри клетки, приводящих к перестройке цитоскелета, перераспределению адгезивных контактов, стимуляции адгезии, миграции и пролиферации клеток. Установлено, что урокиназа вызывает экспрессию матриксной металлопротеиназы-9 в моноцитах, активируя МАР -киназу ERK1,2, а также цитозольную форму фосфолипазы А 2.

• Совместно с отделом атеросклероза показано, что содержание урокиназы в периферической крови больных, подвергающихся ангиопластике и стентированию коронарных артерий, соотносится с высоким риском развития рестенозов, и является предиктором возврата стенокардии.

• Впервые установлено взаимодействие урокиназы со связывающим интегрин белком внеклеточного матрикса фибулином-5. Показано, что фибулин-5 влияет на такие зависимые от интегрина эффекты урокиназы, как пролиферация и миграция клеток, внутриклеточная сигнализация.

• Выявлен новый путь сигнализации урокиназы, регулирующий экспрессию генов, опосредованный быстрой зависимой от нуклеолина транслокацией урокиназы в ядро, и ответственный за фенотипическую трансформацию фибробластов в миофибробласты.

• На основании данных ЯМР-анализа описан новый механизм взаимодействия урокиназы с урокиназным рецептором, согласно которому β-слои в ростовом домене не являются необходимым элементом для взаимодействия с урокиназным рецептором. О бязательным и достаточным условием для взаимодействия с рецептором является наличие Ω-петли в ростовом домене. Эти результаты открывают новые возможности для направленного поиска антагонистов рецептора урокиназы путем конструирования пептидов, содержащих Ω-петлю ростового домена.

• Совместно с сотрудниками НИВЦ МГУ с помощью методов компьютерного моделирования создан новый ингибитор протеолитической активности урокиназы для дальнейшего использования, как для научно-исследовательских, а также возможно и терапевтических целей.

• Получены данные о негативном влиянии протеолитически неактивных рекомбинантных форм урокиназы (uPA HQ и аминотерминального фрагмента) на спонтанную миграцию эндотелиальных клеток, а также показана способность аминотерминального фрагмента подавлять стимулированный основным фактором роста фибробластов ангиогенез in vitro. Результаты указывают на возможность использования созданных протеолитически неактивных рекомбинантных конструкций урокиназы для регуляции миграции эндотелиальных клеток и подавления неангиогенеза.

• Сотрудниками лаборатории выделены и охарактеризованы мезенхимные стволовые клетки (МСК) жировой ткани. Обнаружена способность этих клеток стимулировать регенерацию тканей, индуцировать рост кровеносных сосудов и нервов. Выявлены механизмы такой стимуляции, установлено, что стимулирующее влияние МСК обусловлено как растворимыми продуктами секреции (факторами роста, цитокинами и хемокинами), так и генерацией микровезикул. Оценено влияние воспаления и гипоксии на функциональную активность этих клеток. В сотрудничестве с лабораторией ангиогенеза получены данные, касающиеся влияния гипергликемии на основные функциональные свойства эндотелиальных клеток, мезенхимальных стволовых клеток и циркулирующих прогениторных клеток, определяющие их участие в процессах ангиогенеза. Полученные данные показывают, что культивирование эндотелиальных клеток в условиях, моделирующих гипергликемию, подавляет их способность к направленной миграции и формированию сосудоподобных структур на Матригеле, а также экспрессию рецепторов к VEGF в этих клетках. Культивирование МСК в условиях, моделирующих гипергликемию, изменяет экспрессионный профиль этих клеток, уменьшает их способность стимулировать ангиогенез через паракринную активность.

• Установлено, что скорость миграции мезенхимных клеток контролируется рецептор-зависимым механизмом, включающим активацию НАДФН-оксидаз (NOX), образование активных форм кислорода и накопление внутри клеток пероксида водорода. Установлено, что пероксид водорода действует как вторичный посредник, активируя PI3-киназный каскад и фосфорилирование протеинкиназы В/Akt, тем самым ускоряя миграцию клеток.

• Описан новый транскрипционный фактор Prep1 и механизм регуляции активности PPARγ – мастер-регулятора адипогенеза и липидного метаболизма. Показано, что Prep1 относится к семейству гомеобокс-содержащих факторов, которые критически важны для дифференцировки клеток, в том числе в адипоцитарном направлении. Получены данные о том, что Prep1 может регулировать чувствительность клеток к действию инсулина.